Die spanischen Habsburger waren streng katholisch und sahen es als ihre Pflicht, den Katholizismus in enger Allianz mit dem Papsttum zu verteidigen. Der Großteil der flämischen Bevölkerung wandte sich im Lauf des 16. Jahrhunderts jedoch der Reformation, v. a. dem Calvinismus, zu. Als 1555 Philipp II. von Spanien (†1598) die Regierung der Niederlande von seinem Vater Karl V. übernahm, verstärkte sich der bereits unter dessen Herrschaft entstandene Religionskonflikt. Nun saß ein katholischer Eiferer auf dem Thron, der mit starken Steuererhöhungen, der Entmachtung des Landadels und mit strengen Gesetzen gegen Ketzer alle Stände der Bevölkerung gegen sich aufbrachte. Die Situation wurde durch Handelskonflikte, eine große Konjunkturflaute sowie Ernteausfälle verstärkt. 1566 eskalierte die Wut gegen die von der Bevölkerung mittlerweile als aufgezwungen empfundene Fremdherrschaft: Die Calvinisten verwüsteten zahlreiche Kirchen samt Inventar. Philipp II. setzte daraufhin 1567 Fernando Álvarez de Toledo, Herzog von Alba, als Statthalter ein, der jede Kritik mit Inquisition, Folter und Tod zu ersticken versuchte. Seine Maßnahmen waren jedoch extrem kostspielig und führten zum Bankrott des spanischen Königs. 1576 kam es deshalb zur sogenannten „Spanischen Furie“, der Plünderung und Brandschatzung von Antwerpen durch die spanischen Söldner, die keinen Sold mehr erhalten hatten. Ab 1579 war die Stadt fest in den Händen der Aufständischen. Die königlichen Truppen konnten die Stadt erst 1585 zurück erobern und Protestanten wurden vertrieben.
1609 bis 1621 herrschte Waffenstillstand zwischen den verfeindeten Gegnern. Doch erst der „Westfälische Frieden“ 1648 bedeutete ein Ende des sogenannten 80jährigen Krieges. Jedoch sah der Frieden vor, dass die Schelde nicht mehr genutzt werden konnte, der Niedergang der Stadt war nun endgültig besiegelt.